InSphero Akura PLUS 懸滴培養系統包含Akura PLUS Hanging Drop Plate (“PLUS Plate") （圖1左）和Akura 96 Spheroid Microplate（圖1右）兩個組件。PLUS Plate中形成的懸滴有助于增殖較慢或成球困難的細胞的3D細胞模型的構建和測試。當在顯微鏡下觀察到細胞形成微球之后即可將細胞微球轉移至96微球培養板中繼續培養并進行測試實驗。微球培養板獨特的SureXchange換液平臺可以簡便地實現更溫和培養基交換。Akura系列培養板中產生的細胞微球大小均勻，適用于開展高通量、高重復、高可靠性的測試實驗，并能廣泛兼容多種終點分析和生化分析以及大多數高分辨率的細胞成像應用。
圖1 InSphero Akura PLUS 懸滴培養系統結構示意圖
以下實驗方案描述了使用InSphero Akura PLUS 懸滴培養系統生成3D腫瘤微球的實驗方法，旨在為成功開展實驗提供詳細的指導，并提高頭次使用產品的體驗。本方案包括了培養板的準備、單細胞懸液的制備、細胞懸滴制備、細胞懸滴轉移、換液操作以及建議的質量控制步驟。
• 凍存的HCT-116細胞（人結腸癌細胞系：ATCC，CCL-247）
• 適宜的細胞培養基
• T75細胞培養瓶（Greiner，658175）
• InSphero Akura PLUS Hanging Drop System
• 無菌PBS緩沖液（無鈣鎂離子）（Sigma-Aldrich，D1408）
• 胰酶
• 70%乙醇
• 血球計數板
• 水浴鍋（設置在37℃）
• 血清移液管（5ml和10ml）
• 離心機
• 一級生物安全柜
• 二氧化碳培養箱（設置在5% CO2濃度和37℃）
• 倒置顯微鏡
• 15ml無菌離心管
• 多通道移液器、適配的無菌吸頭、無菌試劑槽
注意：所有實驗步驟遵照無菌操作規范在生物安全柜中操作。
1. 確保所有細胞培養基標記清晰并在正確的條件下存放。
2. 將培養基預熱至37℃。
3. 向T75中加入5ml預熱的培養基。
4. 在水浴鍋中快速融化細胞。
5. 使用血清移液管吸取5ml預熱的培養基，并于融化的細胞混合，將混勻液轉移至15ml離心管中。
6. 室溫下離心，200 RCF 2min，棄去上清液，并用5ml預熱培養基重懸細胞。
7. 將細胞轉移至T75中。
8. 將T75轉移至二氧化碳培養箱中。
9. 培養24h后，更換培養基，并在顯微鏡下檢查細胞貼附情況。
10. 當細胞達到70-80%交匯度時（約48h）可以用于下游的細胞微球培養。
1. 將培養基預熱至37℃。
2. 將T75從二氧化碳培養箱中取出，使用血清移液管棄去培養基。
3. 向T75中加入10ml的PBS。
4. 輕輕搖晃培養瓶后棄去PBS。
5. 加入1ml的胰酶（1x），于37℃孵育5min。
6. 加入9ml的培養基（含FBS）終止消化。
7. 將細胞液轉移至15ml離心管。
8. 室溫下離心，200 RCF 2min，棄去上清液，并用適量（取決于細胞壓積）預熱培養基重懸細胞。
9. 使用血球計數器（或其他細胞技術方法）進行計數。
10. 調整細胞密度至12500cells/ml（即500 cells/40μl）。
1. 拆開包裝之前，用70%乙醇擦拭Akura PLUS板袋；
2. 無菌條件下打開袋子，取出Akura PLUS板；
3. 向直徑15cm的培養基中加入20ml 濃度為0.5% 的PBS溶液，將加濕墊放入0.5%PBS中浸濕（約5min）。
4. 將加濕墊放入到加濕槽中，并加入12ml的0.5% PBS。
5. 每孔加入40ul細胞懸液（圖2左）；輕微施加壓力使確保吸頭尖的那一端與PLUS板孔入口緊密接觸（圖2右），以確保液體全部轉移和保證懸滴的均一性。
圖2 在Akura PLUS板中制備懸滴
6. Akura PLUS板放置在5% CO2，37℃恒溫孵育箱中培養。
注意：請小心移動Akura PLUS板，以避免懸滴滴落。
7. 通過加濕墊的切口定期評估球狀體的形成情況。圖3a，3b，3c分別展示了細胞接種30min，1d和3d時球狀體的生長狀態。大約4天后，大多數細胞都能在懸滴中形成細胞微球。
圖3 不同時間點球狀體的形成情況
為了長期培養和實驗分析，需要把懸滴從Akura PLUS板中轉移至Akura 96孔微球培養板中進行培養。
• Akura 96 Spheroid Microplate預濕潤
注意事項：在使用前對Akura 384孔微球培養板進行預濕潤操作，可以有效避免孔內氣泡的產生。
以下操作均在無菌環境下進行：
① 將40ul含FCS或BSA的細胞系培養基小心加入到insphero 384微球培養板的每個孔中，注意吸頭尖的那一端不要觸及到孔的底部。
② 輕輕上下移液孔中的介質（該過程需避免產生氣泡）。
③ 緩慢移除介質。
• 細胞微球轉移
① 利于設計的栓孔結構（圖4）將Akura PLUS板放置在Akura 96孔微球培養板上，此時Akura PLUS板上的懸滴將會與Akura 96孔微球培養板上的孔全部對應。
圖4 InSphero 96孔微球培養板栓孔結構
Note：綠色箭頭所指的是微球培養板的Akura PLUS板精確結合的固定孔，Akura PLUS板上設有位置對應的栓結構。
② 通過Akura PLUS板的孔入口緩慢加入70ul培養基（≤10ul/sec），吸頭尖的那一端與孔的入口接觸并施加輕微壓力，將懸滴轉移到Akura 96孔微球培養板中（如圖5）。
③ 通過導致顯微鏡觀察來驗證微球轉移。
④ 微球轉移后，將Akura 96孔微球培養板放置在微孔板離心機中，在250rcf條件下離心2min，是細胞微球沉降到孔的底部，并清除氣泡。
⑤ 為了確保每個孔中培養基的體積的準確性，可以先將孔的培養基去除，并重新加入70ul新鮮培養基。
圖5 細胞微球Akura PLUS板轉移至Akura 96微球培養板
⑥將Akura 96微球培養板放入5%CO2,37℃恒溫培養箱中繼續培養。
InSphero Akura 96微球培養板獨特的孔結構可以實現高效、便捷的換液操作，同時可以有效避免微球損失和微球丟失。培養基更換流程如圖6所示。
① 將吸頭尖的那一端放置在孔邊緣的平臺上，以≤30ul/sec的移液速度緩慢吸出孔中的培養基；孔中將會有5-7ul的培養基殘留；
② 將吸頭尖的那一端放在孔邊緣的平臺上，以≤50ul/sec的移液速度緩慢加入新鮮培養基。
③ 將Akura 96微球培養板放入5%CO2，37℃恒溫培養箱中繼續培養。
圖6 Akura 96微球培養板培養基換液流程
說明：本文內容僅介紹InSphero Akura PLUS懸滴培養系統在進行3D細胞模型構建應用中操作過程的介紹，不包含結果分析。對結果分析感興趣的讀者可以參考以下資源和文章：
1、P. Beauchamp, et al., Development and Characterization of a Scaffold-Free 3D Spheroid Model of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Human Cardiomyocytes, Tissue Eng., Part C, 2015, 21(8), 852–861
本文基于InSphero公開資料由其中國提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享和實驗參考。上海曼博生物可提供InSphero Akura PLUS懸滴培養系統、Akura PLUS Hanging Drop Plate、Akura 96 Spheroid Microplate、3D腫瘤微球構建、HCT116細胞3D模型培養、細胞懸滴培養、微球轉移及培養基更換相關產品與技術支持，助力3D細胞模型構建、高通量藥物測試和高分辨率細胞成像應用。也可掃描下方圖片訪問曼博生物網站查看具體詳情！
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