為什么有時候用等度洗脫，有時候用梯度洗脫？

經常接觸液相的小伙伴肯定都知道等度洗脫和梯度洗脫這兩種說法。顧名思義，等度洗脫是流動相中有機相和水相比例一直保持在一個值不變化；梯度洗脫則是比例隨著時間的變化而變化。

那么，這兩者的區別是什么呢？什么時候該用哪種洗脫方式？下面用作者的理解和大家分享。

化合物在色譜柱種“跑步”

在色譜柱中，化合物因為極性不同，因此在流動相和固定相之間的保留能力不同，從而發生分離。換句話說，因為化合物“跑”的速度不同，在同樣長度的色譜柱中，自然到達“終點”的時間也不同。

可以把色譜分離比作100米賽跑：

跑道 → 色譜柱

運動員 → 化合物

運動員跑步的速度主要取決于其實力和狀態，當然場地、跑鞋、風阻等也可能對成績造成影響。在色譜分離中，色譜保留由極性、分配系數、吸附作用、氫鍵、離子作用等共同決定，但要論影響最大的，就是化合物的極性。這相當于是運動員自身的實力和狀態，而流動相成分和比例的改變，則是可以調控化合物“速度”的主要因素。

因此，這里我們可以將運動員的技巧和實力當成是流動相賦予化合物的速度。每個運動員的技巧和實力都不一樣，除了平均速度之外，還存在起跑速度和加速度等差異。假設從起步開始，大家的速度一直保持在各自的最好水平，這種情況下，第一名和最后一名肯定還是差距較大。例如，博爾特和作者相比，分離度會非常理想：博爾特跑100米只需9秒58，而作者9秒58只能跑50米。

然而，當水平相當時，第一名和第二名到達終點的時間差可能很小，甚至只有零點幾秒或零點零幾秒。這對應到色譜中，就是極性相似的化合物如果速度一直不變，很難分開。要不把跑道變長，要不命令他們將各自的速度等比例下降，但這樣會增加分析時間、浪費資源、提高檢測成本，還可能導致峰形變差。

幸運的是，如上所述，由于每個運動員的實力和技巧不同，他們可以跑得不一樣，這正是我們可以利用的特點。通常，實力更強的運動員（即初速度更大）、技巧更高（加速能力更強），在同樣條件下能夠達到更大的速度差異，如下圖所示。

這相當于是對他們下了另外一個命令，按照不同的加速度來加速，跑最快的博爾特不但一開始就跑得快，加速也快，諾亞·萊爾斯的加速會慢一點，而像作者的話加不加速也無所謂了。

等度洗脫與梯度洗脫

現在回到一開始的問題，分離其實就是通過控制流動相的比例，來調節化合物的速度。等度和梯度洗脫的本質區別就是給化合物下達不同的命令：

等度洗脫：可通過調整比例、柱溫、pH改變化合物的保留。

梯度洗脫：通過連續或階梯改變洗脫強度。

所以，什么時候該用等度洗脫，什么時候該用梯度洗脫，答案就清楚了。

我們想要的理想結果是：化合物在達到色譜柱終點的時候能有很好的分離度。

就像賽跑中，運動員沖線之后，我們可能無法馬上知道誰是，還得靠儀器判定；而在色譜分析中，我們當然希望用眼睛就能直接區分各組分。

案例分析

色譜柱：Ultimate XB-C18 4.6×100 mm 3μm

等度洗脫

流動相：A = 乙腈，B = 0.1%甲酸水溶液

比例：A:B = 5:95

流速：0.5 mL/min

總結與建議

一般情況下，可以使用保留差異（k 值范圍）來判斷是否使用梯度洗脫，通常認為 1 < k < 10 是最佳保留范圍。對于組分較多的情況，也可放寬到0.5~20，因此色譜中的目標物可根據此參考值來選擇適合的洗脫方式進行調整。

但這并不是絕對的，需要我們根據實際情況來進行分析，歡迎大家進行討論和經驗交流。