抗體技術(shù)的明星——重組兔單克隆抗體

抗體是現(xiàn)代生物醫(yī)學研究和診斷的重要工具，尤其是單克隆抗體（簡稱單抗），因為其特異性強、重復性高，一直是科研和臨床領(lǐng)域的寵兒。然而，傳統(tǒng)的單抗制備方法也存在一些局限性。近年來，重組兔單克隆抗體的興起，為解決這些問題帶來了新的可能。

為什么是重組兔單克隆抗體？

重組兔單克隆抗體結(jié)合了兔免疫系統(tǒng)的獨特優(yōu)勢和現(xiàn)代基因工程技術(shù)，具有多方面的優(yōu)點：

圖1:天然兔、鼠、雞和人免疫球蛋白示意圖

兔單克隆抗體的開發(fā)的技術(shù)路線

目前對于兔單克隆抗體的開發(fā)一共有3大技術(shù)路線，一是傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)平臺，該技術(shù)篩選的是抗體分泌型漿B細胞（Plasma B cells）； 二是噬菌體展示技術(shù)，該技術(shù)直接對B細胞進行測序和建庫，抗體序列來源可以是漿細胞也可以是記憶細胞（Memory B cells）；三是基于單B細胞直接測序或者基于B細胞體外培養(yǎng)篩選后測序技術(shù)，該技術(shù)抗體序列來源可以是漿細胞也可以是記憶細胞。

1.雜交瘤技術(shù)

小鼠雜交瘤技術(shù)依賴于B細胞與骨髓瘤伙伴的細胞融合，自1975年被發(fā)現(xiàn)以來，是一種傳統(tǒng)的、廣泛和最成功地用于生產(chǎn)小鼠單抗的方法(圖2)。該方法將免疫小鼠的淋巴細胞與BALB/c小鼠骨髓瘤細胞融合形成永生化雜交瘤細胞，然后對雜交瘤細胞進行篩選，以鑒定產(chǎn)生相同抗體的特定克隆(圖2)。

雜交瘤技術(shù)是一種成熟的制備鼠源性單抗的方法，并被廣泛用于生產(chǎn)各種應用的抗體。然而，由于缺乏合適的骨髓瘤配對，雜交瘤方法大多局限于嚙齒動物免疫。在20世紀80年代，一種用于生產(chǎn)治療性抗體的人類雜交瘤技術(shù)被開發(fā)出來，這種抗體可以產(chǎn)生天然形式的人類抗體。這種人類雜交瘤技術(shù)開發(fā)了另一種有用的方法來產(chǎn)生治療性抗體，而不需要額外的修改。許多研究致力于這項技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)了幾個有用的人類融合伙伴細胞系。基于更好的融合伙伴的發(fā)展和使用電融合的技術(shù)進步，提高了人雜交瘤融合的成功率，這可以在不久的將來推動治療性抗體的發(fā)展。

2.噬菌體展示技術(shù)

自20世紀90年代初，噬菌體展示技術(shù)被探索為一種新的產(chǎn)生單抗的方法。在這種方法中，從淋巴細胞中獲得V基因庫，并將VHS和VLS的組合克隆到絲狀噬菌體的表面并通過與其外殼蛋白的融合表達(圖2)，然后選擇在其頂端含有表達特異性單抗的噬菌體顆粒用于常規(guī)檢測，與實際上僅限于嚙齒動物的雜交瘤技術(shù)相比，噬菌體展示技術(shù)已成功地用于從任何已知免疫球蛋白基因的物種中篩選和分離單抗。2000年，Rader等人首先描述了用噬菌體展示技術(shù)篩選兔單抗的全過程，該技術(shù)成功地應用于結(jié)腸癌免疫治療靶抗原人A33抗原兔抗體的篩選和人源化，獲得的人源化抗體與人A33抗原具有較高的特異性和親和力。

目前，抗體噬菌體展示技術(shù)以其快速、簡便的抗體生成和體外控制各種選擇參數(shù)的能力，是產(chǎn)生用于治療目的抗體的主要技術(shù)平臺，根據(jù)我們對抗體結(jié)構(gòu)、功能和序列多樣性的了解，除了從以前的抗體庫中獲得的見解外，一種新的合成抗體庫技術(shù)被開發(fā)出來，并通過將精確設(shè)計的序列插入到抗原結(jié)合位點來用于mAb的生產(chǎn)，這項技術(shù)是基于遺傳復制免疫球蛋白片段和使用分子生物學技術(shù)在體外使抗體副表位多樣化而完成的，設(shè)計了幾個具有多個可變重鏈和輕鏈骨架區(qū)域的合成抗體庫，并用于分離優(yōu)化的分子識別人單。

3.單B細胞開發(fā)技術(shù)

盡管雜交瘤篩選與展示技術(shù)已被應用于兔源單克隆抗體的生產(chǎn)，但二者均存在局限性：雜交瘤技術(shù)存在細胞融合效率低的問題，而展示技術(shù)則易導致抗體VH與VL的天然配對丟失。

為克服上述缺陷，單B細胞抗體技術(shù)近年來迅速發(fā)展（圖2C），該技術(shù)流程包括：

（1）從外周血或淋巴組織中通過隨機分選或FACS鑒定并分離特異性單B細胞；
（2）利用抗體特異性引物進行單細胞逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）；
（3）通過PCR擴增免疫球蛋白（Ig）基因并進行測序；
（4）將Ig基因克隆至表達載體；
（5）在大腸桿菌等原核系統(tǒng)或HEK 293、CHO等真核系統(tǒng)中表達抗體蛋白；
（6）通過蛋白純化及酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）評估抗體活性。

單B細胞抗體技術(shù)是高效和穩(wěn)健的，可以在短時間內(nèi)從免疫兔中產(chǎn)生大量抗原特異性重組抗體。這種方法已用于產(chǎn)生一些治療性中和單克隆抗體，用于治療多種疾病，包括癌癥、自身免疫性疾病和傳染病，例如，使用單B細胞抗體技術(shù)從HIV患者中分離出幾種有價值的mAb用于臨床診斷。

圖2.概述抗原特異性單抗產(chǎn)生的流程圖。(A)小鼠雜交瘤方法。(B)噬菌體展示方法。(C)單一B細胞抗體技術(shù)。

斯達特重組兔單克隆抗體

重組兔單抗是一種通過基因工程技術(shù)，從兔子免疫系統(tǒng)中提取抗體基因，再在體外重組和生產(chǎn)的單克隆抗體。這種方法不同于傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)（通常用小鼠來制備抗體），不需要依賴動物細胞直接生產(chǎn)抗體，而是通過精確的基因操作實現(xiàn)抗體的定向設(shè)計與制造。斯達特提供重組兔單克隆抗體開發(fā)服務，流程中包含了多重特異性篩選，以確保抗體的高度特異性和高親和力。

重組兔單克隆抗體的技術(shù)路線

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