CRISPR-Cas9 是一種基因編輯技術，它允許科學家們精確地修改 DNA。這個名字來源于"Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats"，指的是細菌和古生菌基因組中一種獨特的 DNA 序列。Cas9 是一種酶，它能夠切割 DNA。CRISPR-Cas9 原本是細菌為了抵抗噬菌體進化出來的一種防御機制，但是由于起機制的破譯，現已成為了一種基因編輯的工具。且隨著研究的進一步深入，還發展出了先導編輯，單堿基編輯等更多更加精準的編輯體系。
圖 1 CRISPR 系統是細菌/古菌的天然免疫防疫系統
CRISPR 發展歷程：
圖 2 Key Studies Characterizing and Engineering CRISPR Systems
CRISPR-Cas9 的工作原理：
CRISPR-Cas9 的工作原理可以分解為幾個關鍵部分：
- CRISPR 序列（"指南針"）： CRISPR 序列并非直接用于編輯，而是充當了系統的"指南針"。在細菌的免疫系統中，這些序列是病毒 DNA 的片段，被細菌儲存起來，用于識別并對抗未來的病毒感染。
- 向導 RNA (gRNA)： 在基因編輯應用中，科學家會人工合成一種叫做"向導 RNA"（guide RNA，簡稱 gRNA）的分子。gRNA 由兩部分組成：
- CRISPR RNA (crRNA)： 這部分序列是經過設計的，與目標 DNA 序列的特定區域（通常是 20 個核苷酸）匹配。它就像一個精確的"地址標簽"，告訴 Cas9 酶要去 DNA 的哪個位置。
- 反式激活 CRISPR RNA (tracrRNA)： 這部分 RNA 負責將 crRNA 招募到 Cas9 酶上，并穩定 Cas9 酶的活性。在實際應用中，crRNA 和 tracrRNA 通常被設計成一個單一的分子，即 gRNA。
- Cas9 酶（"剪刀"）： Cas9 是一種能夠切割 DNA 雙鏈的核酸酶。它本身并不知道要去哪里切割 DNA，它需要 gRNA 來引導。根據目前對 CRISPR--cas 系統的分類，CRISPR 系統已被分為六種不同類型（I--VI），每種類型都利用一組獨特的 Cas 蛋白以及 crRNA 來實現 CRISPR 干擾。其中 I 型和 III 型系統利用大型多 Cas 蛋白復合物進行 crRNA 結合和靶序列降解，而 II 型 CRISPR 系統則采用單一的 DNA 核酸內切酶 Cas9 來識別雙鏈 DNA 底物，并通過不同的核酸酶結構域（HNH 或 RuvC）切割每條鏈。
圖 3 不同亞型代表性 Cas9 同源蛋白的結構域組織示意圖。
- PAM 序列（"定位標記"）： Cas9 酶在切割 DNA 時，還需要識別 DNA 序列中一個簡短的"原型間隔基相鄰基序"（Protospacer Adjacent Motif，簡稱 PAM）。PAM 序列通常是 NGG（N 可以是任何核苷酸）。PAM 序列的存在是 Cas9 酶能夠識別并結合到目標 DNA 位點的一個關鍵先決條件，它確保 Cas9 酶不會錯誤地切割細菌自身的 CRISPR 區域。
圖 4 CRISPR-Cas9 系統示意圖
工作流程：
- 結合： 人工合成的 gRNA 會與 Cas9 酶結合，形成一個復合物。
- 定位： 這個 Cas9-gRNA 復合物會在 DNA 中尋找與 gRNA 的 crRNA 部分匹配的序列。
- 識別 PAM： 一旦找到匹配的 DNA 序列，Cas9 還需要識別其附近的 PAM 序列。
- 切割： 當 gRNA 和 PAM 都被識別后，Cas9 酶就會在目標 DNA 位點執行切割，產生一個 DNA 雙鏈斷裂（Double-Strand Break, DSB）。
DNA 的修復機制：
一旦 DNA 發生雙鏈斷裂，細胞自身就會啟動修復機制：
- 非同源末端連接 (NHEJ)： 這是細胞中最常見的修復方式。它是一種"簡單粗暴"的修復方式，容易在斷裂處引入小片段的插入或刪除（indels），從而導致基因失活（基因敲除）。
- 同源定向修復 (HDR)： 如果在細胞中提供一個與斷裂位點同源的 DNA 模板，細胞就可以利用這個模板進行精確修復。科學家可以利用這個機制，在斷裂處插入新的 DNA 序列，從而實現基因的精確修改（基因敲入）。
圖 5 . Double stranded break (DSB), endogenous DNA repair can occur by (A) non-homologous end joining (NHEJ) resulting in random indels, or by (B) homology-directed repair (HDR) which uses a template DNA strand for precise repair.
CRISPR-Cas9 的重要性和應用：
CRISPR-Cas9 技術之所以如此重要，是因為它具有以下優點：
- 精確性高： 能夠非常精確地靶向基因組中的特定位置。
- 操作簡便： 相較于之前的基因編輯技術，CRISPR-Cas9 更易于設計和操作。
- 成本較低： 使得基因編輯技術更加普及。
- 高效性： 能夠相對高效地實現基因編輯。
這些優勢使得 CRISPR-Cas9 在各個領域都展現出巨大的潛力：
- 基礎科學研究： 用于研究基因功能、構建基因敲除/敲入模型。
- 疾病治療：
- 基因療法： 糾正導致遺傳性疾病的基因缺陷。
- 癌癥治療： 增強免疫細胞攻擊癌細胞的能力，或直接靶向癌細胞中的致病基因。
- 傳染病防治： 靶向病毒基因組，阻止病毒復制。
- 農業：
- 作物改良： 培育具有抗病、抗蟲、耐旱、高產等優良性狀的作物。
- 畜牧業： 培育更健康的動物，提高產量。
- 生物技術： 用于合成生物學、開發新的生物材料等。
圖 6 Applications of Genome Engineering
在CRISPR-Cas9 實操中，構建cas9 穩轉株 或者共轉染cas9 和sgRNA是非常常見的手段。 cas9 蛋白是否能在靶細胞中表達是基因編輯是否成功的關鍵之一。因此需要通過WB 等方式來檢測cas9 可以說非常有必要的。 斯達特旗下Anti-Cas9 重組兔單抗，可用于CRISPR-Cas9 基因檢測，助力CRIPSR QC。
Cas9 Recombinant Mouse mAb (S-R500)（貨號：S0B1270）
驗證數據：
WB result of Cas9 Recombinant Mouse mAb
Primary antibody: Cas9 Recombinant Mouse mAb at 1/2000 dilution
Lane 1: 293T transfected with empty vector whole cell lysate 5 µg
Lane 2: 293T transfected with Cas9-Myc-His fusion protein whole cell lysate
Secondary antibody: Goat Anti-mouse IgG, (H+L), HRP conjugated at 1/10000 dilution
Predicted MW: 150 kDa
Observed MW: 170 kDa
ICC shows positive staining in Cas9-Myc-His transfected 293T cells (top panel) and negative staining in vector-transfected 293T cells (below panel). Anti- Cas9 antibody was used at 1/500 dilution (Green) and incubated overnight at 4°C. Goat polyclonal Antibody to Mouse IgG - H&L (Alexa Fluor® 488) was used as secondary antibody at 1/1000 dilution. The cells were fixed with 4% PFA and permeabilized with 0.1% PBS-Triton X-100. Nuclei were counterstained with DAPI (Blue). Counterstain with tubulin (Red).
斯達特熱門抗體
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Cas9重組兔單抗，CRISPR 基因編輯檢測好幫手
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